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Mise en place d’une méthode semi-quantitative en toxicologie clinique par UHPLC-PDA en utilisant une extraction SPE en micro-élution

Establishment of a UHPLC-PDA semi-quantitative method in clinical toxicology using a SPE micro-elution extraction

¹ UFR Biomédicale, Université Paris Descartes, Rue des Saints-Pères, 75005 Paris, France
² Department of Pharmaceutical Biosciences, Uppsala University, Husargatan 3, 75123 Uppsala, Suède
³ Laboratoire de Toxicologie, Centre Hospitalier René Dubos, 6 avenue d’Île de France, 95303 Pontoise, France
⁴ AFPreMed, Groupe de Recherche Toxicologique, 9 rue du Pr Antoine Baisset, 31000 Toulouse, France

^⋆ Correspondance : Salim Bouchene, salim.bouchene@gmail.com

Reçu : 26 Août 2012
Accepté : 24 Septembre 2013

Résumé

Objectifs : Une méthode semi-quantitative en toxicologie clinique a été développée utilisant une extraction par micro-élution en phase solide suivie d’une analyse par un système de chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à une spectrométrie UV-visible à barrettes de diodes (PDA) (UHPLC-PDA). Cette étude a été réalisée sur 122 molécules médicamenteuses en respectant les recommandations de la norme NF EN ISO 15189. Méthodes : Parmi différentes cartouches SPE (Solid-Phase Extraction) testées, la cartouche Strata®-X a été sélectionnée pour ses meilleurs rendements d’extraction. Un protocole d’extraction manuelle à partir de plasma sanguin a été mis en place pour 3 concentrations (0,1 mg/L, 1 mg/L et 10 mg/L) avec le méthanol comme solvant d’élution. La séparation sur UHPLC a été réalisée avec un gradient de phase mobile acétate d’ammonium 5 mM/acétonitrile (ACN) (85/15; V/V) à pH 3,8 ± 0,05 et d’ACN sur une colonne BEH C18 1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm avec un débit de 0,45 mL/min. Les analytes ont été détectés par PDA (190–400 nm). Résultats : Les rendements d’extraction étaient satisfaisants de même que la précision (CV% répétabilité < 6,54 %). Les CV inter-essais étaient élevés (CV > 15 % pour certaines molécules) mais diminuaient lorsqu’ils étaient rapportés aux 2 étalons internes (flurazépam et prazépam). La semi-quantification s’est faite à l’aide de 2 facteurs de réponses et les LOD et LOQ ont été comparées aux valeurs thérapeutiques ou toxiques. Conclusion : La méthode décrite est simple et rapide. Les résultats ont montré la capacité de la cartouche Strata®-X à extraire des molécules appartenant à plusieurs classes pharmacologiques avec des propriétés physico-chimiques différentes.

Abstract

Objectives: A semi-quantitative method in clinical toxicology was developed using an extraction with a micro-elution solid phase (SPE) followed by an analysis with an Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array system (UHPLC-PDA). The study was performed on 122 medicinal compounds according to the recommendations of the NF EN ISO 15189. Methods: After testing different SPE cartridges, the Strata®-X cartridge was selected based on its better extraction yields. A manual extraction protocol from plasma was set up for 3 concentrations (0.1 mg/L, 1 mg/L and 10 mg/L) with methanol as the eluting solvent. UHPLC analysis was performed with a mobile phase gradient of ammonium acetate 5 mM/Acetonitrile (ACN) (85/15, v/v) at pH 3.8 ± 0.05 and ACN on a BEH column C18 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm. The flow rate was 0.45 mL/min and the analytes were detected by PDA (190−400 nm). Results: Extraction yields were satisfactory, as well as the precision (repeatability CV% < 6.54%). Inter-assay CVs were high (CV > 15% for a few molecules) but were less significant when relativized by the two internal standards (flurazepam and prazepam). The semi-quantification was achieved with the support of two endpoints, and LOD and LOQ values were compared with therapeutic or toxic values. Conclusion: The method described is simple and fast.The results showed the ability of the Strata®-X to extract molecules belonging to several classes of drugs with different physicochemical properties.