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Development and validation of a GC-MS/MS method for the determination of ethylglucuronide in human urine and serum

Développement et validation d’une méthode de dosage de l’éthylglucuronide dans l’urine et le sérum par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem

¹ EA4483, Faculté de Médecine/Pôle Recherche, Université Lille-Nord de France, 1 place de Verdun, 59045 Lille Cedex, France
² Laboratoire de Toxicologie, Centre de Biologie-Pathologie, CHRU de Lille, Bd du Pr. J. Leclercq, 59037 Lille Cedex, France
³ Institut de Médecine Légale, CHRU de Lille, Rue du Pr. A. Verhaeghe, 59037 Lille Cedex, France

^⋆ Delphine Allorge, dallorge@univ-lille2.fr

Received: 21 July 2011
Accepted: 4 November 2011

Abstract

Objectives: Ethyl-β-D-6-glucuronide (EtG) is a minor phase-II metabolite of ethanol. The aim of this work was to develop and validate a gas chromatography negative chemical ionization tandem mass spectrometry (GC-NCI-MS/MS) method to measure EtG levels in human urine and serum with both high sensitivity and specificity. Methods: EtG was extracted and purified from 1 mL urine or 0.5 mL serum by solid-phase extraction (SPE) using Mixed-mode Anion-eXchange (Oasis®MAX) extraction cartridges, followed by derivatization with pentafluoropropionic anhydride (PFPA). The analysis was performed in the multiple reaction monitoring (MRM) mode using the transitions m/z 496→163 (for EtG quantification), m/z 347→163 and m/z 496→119 (for identification), and m/z 501→163 for the internal standard EtG-D5. The validation procedure was performed according to the guidelines of the French Society of Analytical Toxicology (SFTA) and the French Committee of Accreditation (COFRAC; LAB GTA 04). Results: Calibration curves were linear in the concentration range of 10 to 10 000 ng/mL and 5 to 1 000 ng/mL in urine and serum, respectively, with a coefficient of correlation (r) above 0.996. The LOD and LOQ values were 5 and 10 ng/mL, respectively, for both matrices. The intra- and inter-day precision (relative standard deviation RSD%) and relative bias were less than 20%. Conclusion: To our knowledge, this is the first report of the application of a GC-MS/MS method for EtG measurement in urine and serum. The LOQ achieved appears to be better than those reported in the literature using other validated analytical techniques. This method could be used routinely for EtG measurement in various clinical and forensic contexts.

Résumé

Objectif : L’éthylglucuronide (EtG) est un métabolite mineur de l’éthanol, utilisé comme biomarqueur d’alcoolisation. Ce travail a consisté à développer une méthode simple et rapide de dosage de l’EtG dans l’urine et le sérum par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem (GC-MS/MS). Méthodes : L’EtG a été extrait et purifié à partir d’1 mL d’urine ou de 0,5 mL de sérum par extraction en phase solide, puis dérivé par l’anhydride pentafluoropropionique (PFPA). L’acquisition a été réalisée en mode MRM (multiple reaction monitoring) à l’aide des transitions 501→163 pour l’étalon interne EtG-D5, 347→163 et 496→119 pour l’identification de l’EtG et 496→163 pour la quantification de l’EtG. La validation de la méthode a été réalisée selon les recommandations de la SFTA et du COFRAC. Résultats : La linérarité de la méthode a été démontrée pour une gamme de concentrations de 10 à 10 000 ng/mL dans l’urine et de 5 à 1 000 ng/mL dans le sérum, avec un coefficient de corrélation (r) supérieur à 0,996. Les limites de détection et de quantification (LDQ) sont respectivement de 5 et 10 ng/mL dans les deux matrices. La répétabilité et la reproductibilité de la méthode ont été démontrées, avec un coefficient de variation inférieur à 20 %. Conclusion : Une méthode de dosage par GC-MS/MS de l’EtG dans l’urine et le sérum a été développée et validée. La LDQ de cette méthode apparaît être meilleure que celles précédemment rapportées dans la littérature avec d’autres techniques. Cette méthode est applicable en routine pour le dosage de l’EtG dans un contexte médical ou médico-légal.