Technique d'extraction de 12 benzodiazépines dans le plasma. Résultats expérimentaux multicentriques

Extraction procedure of 12 benzodiazepinesfrom plasma. Results of a multicentric study

¹ UF Pharmacologie-Département de Biologie et Pathologie de la Cellule, CHU Grenoble
² Laboratoire de Biologie, CH Thionville
³ Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, CHU Dijon
⁴ Laboratoire Toxi-Clinique, CHU Liège
⁵ Laboratoire de Biochimie, CHU Lille
⁶ Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CHU Nantes
⁷ Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CHU Reims
⁸ Laboratoire des Urgences Biochimiques et Toxicologiques, CHU Lyon-Sud
⁹ UF Pharmaco-Toxicologie et Analyses des éléments trace, CHU Lyon
¹⁰ Laboratoire Claude Bernard, CH Pontoise
¹¹ Laboratoire de Pharmacologie, CHU Angers

Auteur de correspondance : Njourdil@chu-grenoble.fr

Reçu : 1 Septembre 2005
Accepté : 2 Novembre 2005

Résumé

Dans le cadre des différents thèmes de travail proposés aux membres de la commission de Toxicologie Clinique de la SFTA, une étude est réalisée sur l'identification et la quantification simultanée de 12 benzodiazépines dans le plasma. L'objectif est de tester la robustesse d'une technique d'extraction en l'imposant aux différents participants, les conditions chromatographiques de séparation et le mode de détection restant libres, fonctions de l'équipement de chaque laboratoire. L'étude a été réalisée sur une période de 2 mois et demi. Deux échantillons tests de plasmas surchargés avec 12 benzodiazépines à des concentrations thérapeutiques ou supra-thérapeutiques sont adressés à chaque centre d'investigation en vue de leur évaluation. La technique d'extraction utilise un mélange d'hexane / dichlorométhane en milieu tamponné (pH 9.2) et le loflazépate d'éthyle comme standard interne. Une méthode CLHP avec détecteur à barrette de diode est proposée à défaut par le laboratoire coordonnateur aux participants ne disposant pas de technique d'analyse. Sur les 11 participants, 10 utilisent une technique CLHP, un seul une technique CPG. Parmi les techniques CLHP, 2 d'entre elles associent un détecteur de masse, 7 un détecteur à barrette de diodes, 1 un détecteur UV. La technique CPG est associée à un détecteur de masse. L'analyse des résultats montre que la technique d'extraction proposée a été testée avec succès par 8/11 des participants : 4/11 laboratoires sans erreur et 4/11 laboratoires avec 1 ou 2 résultats exclus. Par contre, 3/11 laboratoires ont rencontré des difficultés majeures : un site par la survenue d'émulsions lors du traitement des échantillons tests (plasmas lyophilisés à reconstituer), un site par manque de temps et d'expérience, le troisième mettant en cause le choix du standard interne en technique CPG, le loflazépate d'éthyle n'ayant pas fait l'objet d'une étude préalable par cette technique.

Abstract

Within the framework of the various topics proposed to the SFTA members, a study was conducted on the simultaneous identification and quantitation of benzodiazepines in the plasma. The purpose was to test the reliability of a particular extraction procedure by imposing it to the various participants, the chromatographic conditions of separation and the detection modes remaining free, depending on the equipment available in each laboratory. The study extended over a period of two and a half months. Two plasma specimens containing overloads of twelve benzodiazepines at therapeutic and supra-therapeutic levels were supplied for evaluation to each investigation center. The extraction procedure used a mixture of hexan / dichloromethan with the use of a pH 9.2 buffer and ethyl loflazepate as internal standard. By default a HPLC method was proposed by the coordinating laboratory to the participants who didn't have any methodology. Out of 11 participants, 10 used a HPLC method, only 1 used a GC method. Among the HPLC users, 2 used a mass spectro-metry detector, 7 a photodiode array detector, 1 an UV detector. The GC method worked with a mass spectrometry detector. The analysis of the results showed that the extraction procedure had been successfully tested by 8/11 of the participants: 4/11 have returned results without any mistakes, 4/11 have returned 1 or 2 results that had to be excluded, 3/11 have encountered major difficulties: In one laboratory emulsions occurred while processing the specimens (lyophilised plasma to be reconstituted). One laboratory lacked time and experience. The last one questioned the internal standard choice in the GC method since ethyl loflazepate hadn't been tested beforehand by this GC method.