Quantification du thromboxane B2 par CLHP-ESI-SM • Application à des microsomes de levure exprimant la thromboxane synthase humaine

LC-ESI-MS quantification of thromboxane B2 in yeast microsomes expressing human thromboxane synthase

¹ Laboratoire de Toxicologie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, 3, rue du Professeur Laguesse - 59006 LILLE Cedex
² Équipe d'Accueil 2679, Variabilité génétique des défenses de la muqueuse respiratoire face à son environnement, Faculté de Médecine, Pôle Recherche, place de Verdun - 59045 LILLE Cedex
³ Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, Hôpital Calmette, CHRU de Lille, Boulevard du Professeur J. Leclercq - 59045 LILLE Cedex

Reçu : 4 Novembre 2003
Accepté : 15 Janvier 2004

Résumé

Le but de cette étude était de mettre au point une méthode rapide, sensible et spécifique de quantification du thromboxane B2 (TXB2) par chromatographic liquide haute performance couplée à une interface d'ionisation électrospray et à une détection par spectrométrie de masse (CLHP-ESI-SM), à partir de microsomes de levure exprimant la thromboxane synthase (CYP5A1) humaine. Ce métabolite est le produit d'hydratation stable du thromboxane A2 (TXA2) produit par le CYP5A1 à partir de son substrat, la prostaglandine H2 (PGH2). La quantification du TXB2 a été réalisée à l'aide d'un standard interne deutéré, le 6-céto-PGF1 α-d4, ajouté avant une extraction par le diéthyléther. La séparation chromatographique s'effectue en phase inverse sur colonne XTerra MS C18. L'élution est réalisée en mode isocratique (60 % acétonitrile contenant 0,05 % d'acide formique - 40 % tampon formiate d'ammonium 5 mM, pH 3,0). Le mode d'ionisation électrospray négatif a été retenu pour une meilleure détection du TXB2 et du 6-céto-PGF1 α-d4. Cette technique appliquée avec succès aux microsomes exprimant le CYP5A1 sauvage montre une production croissante et linéaire de TXB2 pour la gamme de concentrations de PGH2 utilisée (0-120 μM). Cette méthode pourra être appliquée à l'analyse de l'activité enzymatique de nouveaux variants de la thromboxane synthase, récemment mis en évidence au laboratoire, et exprimés dans des microsomes de levure.

Abstract

An LC-ESI-MS method for specific, sensitive and rapid quantitative analysis of thromboxane B2 (TXB2) in yeast microsomes expressing human thromboxane synthase (CYP5A1) was developed. TXB2 is a stable, biologically inert metabolite formed from the non-enzymatic hydrolysis of TXA2, which is produced by thromboxane synthase (CYP5A1) from prostaglandin H2 (PGH2). TXB2 was quantified after addition of 6-céto-PGF1 α-d4 as an internal standard, by liquid phase extraction using diethylether and reverse phase LC-ESI-MS. HPLC/MS analysis was performed with a column CI8 XTerra using a mobile phase (60 % acetonitrile with 0.05 % formic acid - 40 % ammonium formiate 5 mM, pH 3.0). The LC system used ion spray interface with MS system in negative ion detection and selected ion recording mode. The method was successfully applied to yeast microsomes expressing human CYP5A1 incubated with PGH2, and TXB2 production appears to be linear for PGH2 concentrations ranging from 0 to 120 μM. This method could be used for the kinetic analysis of new CYP5A1 variants expressed in yeast microsomes, recently identified in our laboratory.