Determination of four benzodiazepines with direct injection of whole blood by a column switching technique

Dosage de quatre benzodiazépines par injection directe de sang total et extraction en ligne de l'échantillon

¹ Institute of Microbiology and Biomedical Science, Marche Polytechnic University, via Conca 71, 60126 Ancona, Italy
² Section of Legal Medicine, Department of Neurosciences, Marche Polytechnic University, via Conca 71, 60126 Ancona, Italy

Corresponding author: r.giorgetti@univpm.it

Received: 6 June 2008

Abstract

Introduction: A simple, sensitive and reproducible method was developed for determination of four benzodiazepines (Clonazepam, Flunitrazepam, Triazolam and Diazepam) with direct injection of whole blood by column switching and UV detection. Methods: Whole blood samples were diluted 1:1 with water and then directly injected onto an Onyx Monolithic C18 column for a preliminary clean-up and then separated with a C18  mm I.D. reversed-phase column at room temperature. The mobile phase of the monolithic column consisted of pH 2.5 phosphate-acetonitrile buffer (85:15 v/v) at flow rate of 2.5 mL/min. The mobile phase of the analytical column consisted of pH 2.5 phosphate-acetonitrile buffer (60:40, v/v) at flow rate of 1.0 mL/min. The detection was carried out at 240 nm. No internal standard was necessary. Results: The method was linear over a concentration range of 0.1–10 μg/mL for Flunitrazepam and Triazolam. For Clonazepam and Diazepam of linearity was over the range 0.3–10 g/mL. Quantification limits ranged from 0.1 to 0.3 μg/mL and detection limits from 0.05 to 0.1 μg/mL. Recovery ranged from 95% to 98%. Within-day and between-day coefficients of variation ranged from 2.1% to 6.2%. The present method has been applied successfully to the determination of toxic concentration of benzodiazepines in forensic toxicology. Conclusion: Monolithic columns have been demonstrated to be suitable for on-line extraction of benzodiazepines in whole blood. Precision, accuracy and sensitivity are similar to those of more time-consuming conventional assays, as manual off-line solid-phase or liquid-liquid extraction, thus offering a more simple and versatile analytical tool. This new method is particularly suitable for the analysis of benzodiazepines in post mortem whole blood, a situation very common in the forensic.

Résumé

Introduction : Pour doser quatre benzodiazépines (clonazepam, flunitrazepam, triazolam et diazepam), une méthode simple et reproductible a été mise au point, par injection directe de sang total avec extraction en ligne et détection UV. Méthodes : Les échantillons de sang total ont été dilués dans de l'eau (1:1), puis injectés directement sur une colonne monolithique Onyx C18 pour le traitement préliminaire. Ils ont ensuite été séparés au moyen d'une colonne en phase inverse C18 150 × 4,0 mm de diamètre intérieur. La phase mobile de la colonne monolithique était constituée d'un tampon phosphate-acétonitryle à pH 2,5 (85:15 v/v) délivrée à un débit de 2,5 mL/minute. La détection a été réalisée à 240 nm. Il n'a pas été nécessaire d'utiliser un étalon interne. Résultats : La méthode s'est révélée linéaire dans l'intervalle de concentrations 0,1–10 g/mL pour le flunitrazepam et le triazolam. Pour le clonazepam et diazepam, la méthode s'est révélée linéaire dans l'intervalle 0,3–10 g/mL. Les limites de quantification étaient situées entre 0,1 et 0,3 g/mL tandis que les limites de détection étaient comprises entre 0,05 et 0,1 g/mL, pour un pourcentage d'extraction entre 95 et 98 %. Les coefficients de variation intra-jour et inter-jour variaient de 2,1 % à 6,2 %. Cette méthode a été appliquée avec succès pour déterminer les concentrations toxiques de benzodiazépines en toxicologie médico-légale. Conclusion : Les colonnes monolithiques se sont révélées adaptées pour l'extraction en ligne de benzodiazepines dans le sang total. La précision, l'exactitude et la sensibilité se sont avérées similaires à celles de méthodes conventionnelles, telle l'extraction manuelle hors ligne en phase solide ou liquide-liquide. Elles constituent ainsi un outil analytique plus simple et plus souple. Cette nouvelle méthode est particulièrement adaptée pour la détection post mortem des benzodiazépines dans le sang total, situation fréquente en médecine légale.