Note de laboratoire : Dosage rapide et spécifique du lévétiracétam (Keppra®) par HPLC/MS

Rapid and specific determination of levetiracetam (Keppra®) in biological fluids by HPLC/MS

¹ Institut de Médecine Légale, Faculté de Médecine de Strasbourg, 11, rue Humann, 67085 Strasbourg Cedex, France
² Service d'Anesthésie et de Réanimation Chirurgicale, Hôpital de Hautepierre, CHRU/Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, 67098 Strasbourg Cedex, France
³ Service de Réanimation Médicale et des Urgences Médicales, Hôpital de Hautepierre, CHRU/Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, 67098 Strasbourg Cedex, France

Reçu : 27 Novembre 2002
Accepté : 20 Janvier 2003

Résumé

Une méthode originale par HPLC/MS est proposée pour l'identification formelle et le dosage du lévétiracétam (LEV ; Keppra®), un nouvel antiépileptique, dans les fluides biologiques. Après micro-extraction en phase liquide de 100 µl d'échantillon par le chloroforme/2-propanol/n-heptane (25 : 10 : 65, v/v) à pH 9,5 en utilisant le prazépam comme standard interne (SI), la séparation s'effectue sur colonne Waters NovaPak C18 (150 x 2,0 mm, i.d.) à l'aide d'un gradient acétonitrile/tampon 2 mM NH₄COOH, pH 3,0. La détection est assurée par le spectromètre de masse API-100 (Perkin-Elmer) avec interface à pression atmosphérique de type ionspray utilisée en mode d'ions positifs ; l'acquisition se fait en courant ionique total ou en SIM à m/z 171,0 ; 154,0 et 126,0 (LEV); et 325,0 (SI). Les temps de rétention moyens du LEV et du SI sont respectivement de 3,60 ± 0,12 min et 8,09 ± 0,27 min ; l'ensemble de la procédure d'analyse nécessite moins de 45 min. Les limites de détection pour le LEV sont comprises entre 150 et 200 μg/l, la limite de quantification est de 500 μ/l dans le sang total, le plasma ou l'urine. La méthode est simple, rapide, sensible et d'une très grande spécificité; elle est appropriée non seulement aux dosages à visée médico-légale mais aussi au monitoring thérapeutique ou à la toxicologie d'urgence. Une application clinique est présentée avec le cas d'un sujet de 66 ans supposé victime d'un surdosage en Keppra®, chez lequel la procédure décrite a permis de caractériser un taux plasmatique à 199,5 mg/l et un taux urinaire à 413,7 mg/l.

Abstract

An original method based upon HPLC/MS is presented for the identification and quantitation of levetiracetam (LEV; Keppra®), a novel antiepileptic agent, in biological fluids. After a liquid/liquid extraction micromethod (100 μl sample) using chloroforme/2-propanol/n-heptane (25 : 10 : 65, v/v) at pH 9.5 and prazepam as internal standard (IS), separation was performed on a Waters NovaPak C18 column ( 150 x 2.0 mm, i.d.), using a gradient of acetonitrile/2 mM NH₄COOH buffer, pH 3.0. Detection was done by a Perkin-Elmer API-100 mass analyzer equipped with an ionspray atmospheric pressure interface, operated in the positive ionization mode. MS data were monitored in the TIC or SIM modes at m/z 171.0, 154.0 et 126.0 (LEV); and 325.0 (IS). The average retention times for LEV and the IS were 3.60 ± 0.12 min and 8.09 ± 0.27 min, respectively ; the whole analytical procedure can be achieved in less than 45 min. LODs were in the range 150-200 μg/l and the LOQ was 500 μg/l in whole blood, plasma, or urine. This method is simple, rapid, sensitive and ultraspecific; it is suitable for both medicolegal and clinical purposes, e.g. therapeutic drug monitoring. As an application, we report the case of a 66-year-old man in which an overdose of Keppra® was suspected; as measured by our procedure, LEV concentrations in plasma and urine were 199.5 and 413.7 mg/l, respectively.